Fettlösliche Vitamine

Effiziente Multimethode zur Analytik fettlöslicher Vitamine

 

Fettlösliche Vitamine zu bestimmen, kann aufwendig sein, muss es aber nicht. Mit einer intelligenten Probenvorbereitungsstrategie und der richtigen Technik lassen sich fettlösliche Vitamine im Rahmen einer Multimethode effizient erfassen und vermessen.

Wir sind darauf angewiesen, bestimmte organische Verbindungen aufzunehmen, weil unser Organismus sie zum Leben braucht, nicht aber in der Lage ist, sie aus sich heraus zu bilden.
Vitamine gehören, mit wenigen Ausnahmen, zu den für uns essenziellen Stoffen. Um den empfohlenen täglichen Bedarf decken zu können, müssen wir nicht nur den individuellen Bedarf kennen. Wir müssen wissen, wie gehaltvoll unsere Nahrung ist. Lebensmittelhersteller sind in der Pflicht, den Nährstoffgehalt ihrer Produkte zu bestimmen und zu deklarieren.Gleiches gilt im übrigen auch für Produzenten freiverkäuflicher Nahrungsergänzungsmittel.

 

Klassische Vitaminanalytik ist aufwendig

Vitamine in Lebens- oder Nahrungsergänzungsmitteln zu bestimmen, insbesondere die fettlöslichen Vitamine E, D, K und A, ist alles andere als trivial. Aufgrund ihres lipophilen Charakters lassen sie sich nur mit unpolaren Lösemitteln wie Essigester oder Hexan aus der Matrix extrahieren.
Für die erforderliche Reversed-Phase-Chromatographie aber werden Laufmittel eingesetzt, die mehr oder weniger polar sind, etwa Acetonitril, Methanol und Wasser.
Das heißt, wer fettlöslich Vitamine in Art und Menge mittels HPLC-Analyse bestimmen will, kommt um einen Lösemittelwechsel nicht umhin. Dieser Schritt erfordert in der Regel, so man ihn manuell ausführt, einiges an Zeit und Arbeitseinsatz.
Zwei weitere Aspekte erweisen sich bei Analyse fettlöslicher Vitamine als Herausforderung.
Zum einen passiert es, dass Fett im Verlauf der Extraktion verschleppt und in den Probenextrakt eingetragen wird; Fett stört jedoch die spätere HPLCAnalyse und ist daher abzutrennen. Ein anderer Punkt ist der oftmals niedrige Vitamingehalt einer Probe, der es schwer macht, Detektions- oder Bestimmungsgrenzen zu erreichen. Vitamin D und Vitamin K kommen in den meisten relevanten Proben in nur sehr niedrigen Gehalten vor.

 

Das Optimierungspotenzial im Blick

Wie auch immer man das Blatt wenden mag: Will man die Effektivität der Analyse fettlöslicher Vitamine steigern, um die Produktivität und Empfindlichkeit zu erhöhen, erweist es sich als sinnvoll und wegweisend, Optimierungspotenzial zu erschließen.
Eben dieses Ziel hat sich die TeLA (Technische Lebensmittel- und Umweltanalytik) gestellt. Bei der Arbeit kristallisierte sich bereits zu Beginn ein interessanter Ansatz heraus, der letztlich in der Entwicklung einer Multimethode mündete, mit der sich erstmals mehrere fettlösliche Vitamine, im vorliegenden Fall Vitamin D, K und E, automatisiert und in nur einem Analysenlauf bestimmen lassen.
Die Basis bildete unter anderem die Einbindung eines Autosamplers, um die erforderlichen, üblicherweise aufwändigen Schritte der Probenvorbereitung insbesondere die Aufreinigung des Probenextraktes und den Lösemittelwechsel zu automatisieren, damit zu vereinfachen und unabhängig vom Laborpersonal möglich zu machen.

 

Automatisierte SPE macht den Unterschied

Eine Schlüsselstellung nahm hierbei die Festphasenextraktion (SPE) ein, der die Aufgabe zukommen sollte, verschleppte Fette aus dem Probenextrakt zu entfernen.
Automatisiert wurde die SPE, wie auch alle weiteren Schritte der Probenvorbereitung
und Probenaufgabe, auf dem Gerstel Multi Purpose Sampler (MPS) in der Dual-Head-Variante. Dieser Samplertyp hat sich bereits in einer Vielzahl von Applikationen bestens bewährt. Der MPS bietet zudem verschiedene interessante Optionen, die in der vorliegenden Applikation benötigt wurden, unter anderem die Möglichkeit, divergente Lösemittel in unterschiedlichen Mengen zu dosieren, ohne Werkzeuge wechseln zu müssen, oder Probenextrakte bis zur Trockene einzudampfen und in einem HPLC-tauglichen Lösemittel wieder aufzunehmen. Untersucht wurde der Gehalt an fettlöslichen Vitaminen in einem vitalisierenden Milchmischgetränk sowie in einem Nahrungsergänzungsmittel.
Die Proben wurde homogenisiert, mit Essigester extrahiert und zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde für die anschließende Analyse verwendet.

Erfolgreicher Einsatz in der Praxis

 

Nach einer Reihe zielführender Experimente wurde folgende Vorgehensweise für
die Bestimmung fettlöslicher Vitamine für gut befunden und in der Routineanalytik
etabliert:
Der MPS konditioniert die SPE-Kartuschen unter Zugabe von Methanol und Essigester auf das C18-Sorbens. Anschließend werden zwei Milliliter Probenextrakt dosiert, um sicherzustellen, dass kein Methanol- oder Essigesterrest auf dem Sorbens zurückbleibt. Der resultierende Extrakt wird verworfen. Sodann werden weitere fünf Milliliter Probenextrakt dosiert.
Die resultierende Lösung wird aufgefangen, in der Multi-Position-Evaporation- Station (mVAP) des MPS bis zur Trockene eindedampft, der Rückstand wird in Acetonitril wieder aufgenommen und zur Analyse auf die Trennsäule gegeben. Für die Analyse verwendet wurde ein LC/MSSystem bestehend aus einer Agilent 1290 HPLC mit 6495 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer von Agilent Technologies (s. Abb. 2). Angelegt wurde ein Lösemittelgradient (A: 5 mM Ameisensäure, B: Methanol; Fluss: 0,5mL, 55 °C), bei der
stationären Phase handelte es sich um ein C18-Reversed-Phase-Material. Detektiert wurde im positiven APCI-Modus.
Nach etwas mehr als neun Minuten zeigte sich das erste Signal (D2) im Chromatogramm,
das letzte nach etwas mehr als elf Minuten (K1) (s. Abb. 3). Alles in allem sind die Peaks hinreichend getrennt und gut auszuwerten. Gestoppt wurde der Lauf nach 17 Minuten. Damit war der Beweis erbracht, dass sich mit vorliegenden HPLC-MS/MS-Methode die drei oben genannten fettlöslichen Vitamine unter optimalen Bedingungen in einem Lauf in hoher Empfindlichkeit und sauber aufgetrennt nachweisen lassen.
Darüber hinaus ergaben Vergleichsmessungen einen signifikanten Unterschied zwischen der Analyse unter Einbindung der Festphasenextraktion (deutlich höhere Empfindlichkeit) und ohne. Zusätzlich brachte die Möglichkeit, Probenvorbereitung und Analysenlauf zeitlich zu verschachteln (Prepahead-Funktion), eine deutliche Beschleunigung der Messung:

Die Aufbereitung und Bestimmung der ersten Probe dauerte 41 Minuten, jedeweitere Probe benötigte nicht mehr als 24 Minuten bis zum Messergebnis.
Last but not least wurden auch die gemessenen Werte mit den Angaben der Deklaration
verglichen. Im Milchmischgetränk wurde das Vitamin-E-Derivat Tocopherolacetat in einer Menge von 174 μg/g nachgewiesen, deklariert waren 200 μg/g.
Beim Nahrungsergänzungsmittel wiederum wies die Deklaration 5,0 μg/g Vitamin K1 und 1,8 μg/g Vitamin D3 aus. Gemessen wurden 4,6 μg/g K1 und 1,5 μg/g D3.

Das bedeutet, auch in puncto Wiederfindung erfüllt die hier vorgestellte HPLCMS/ MS-Methode höchste Ansprüche.

Die Automatisierung führt zudem zu einer guten Wiederholbarkeit.

 

(Autor: Guido Deußing)

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